Cos'è southern blotting?

Southern Blotting

Il Southern blotting è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per rilevare una sequenza di DNA specifica all'interno di un campione di DNA. È stata inventata da Edwin Southern nel 1975.

La procedura coinvolge i seguenti passaggi principali:

  1. Preparazione del campione di DNA: Il DNA viene estratto dalla fonte appropriata (es. cellule, tessuto) e digerito con enzimi di restrizione. Questi enzimi tagliano il DNA in frammenti di dimensioni specifiche, a seconda della loro sequenza di riconoscimento.

  2. Elettroforesi su gel: I frammenti di DNA vengono separati in base alla dimensione tramite elettroforesi su gel di agarosio. I frammenti più piccoli migrano più rapidamente attraverso il gel, mentre quelli più grandi si muovono più lentamente.

  3. Trasferimento (Blotting): Il DNA separato nel gel viene trasferito su una membrana di supporto, tipicamente nitrocellulosa o PVDF (polivinilidenfluoruro). Questo processo mantiene la disposizione spaziale dei frammenti di DNA.

  4. Ibridazione: La membrana viene incubata con una sonda di DNA marcata (ad esempio, con radioattività o enzimi). Questa sonda è una sequenza di DNA a singolo filamento complementare alla sequenza bersaglio che si vuole rilevare. La sonda si lega specificamente alla sequenza complementare sul DNA immobilizzato sulla membrana.

  5. Lavaggio: La membrana viene lavata per rimuovere la sonda non legata.

  6. Rilevamento: La sequenza di DNA bersaglio viene visualizzata rilevando la sonda ibridata. Il metodo di rilevamento dipende dal tipo di marcatura utilizzata sulla sonda (es. autoradiografia per sonde radioattive, reazione enzimatica per sonde enzimatiche).

Applicazioni:

  • Rilevamento di sequenze specifiche: Identificare la presenza di un gene o di una sequenza di DNA specifica in un campione.
  • Analisi di polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP): Determinare le variazioni nella sequenza di DNA tra individui o popolazioni, utile per studi di genetica e identificazione.
  • Mappatura del DNA: Determinare la posizione di un gene o di una sequenza specifica nel genoma.
  • Diagnosi di malattie genetiche: Identificare la presenza di mutazioni o anomalie genetiche associate a malattie.
  • Analisi del numero di copie di geni: Determinare il numero di copie di un gene specifico nel genoma.